Nanoscale-mikroskooppitekniikka antaa tutkijoille mahdollisuuden havaita RNA-molekyylit aivoissa

Anonim

Solut sisältävät tuhansia messenger-RNA-molekyylejä, jotka kantavat kopiot DNA: n geneettisistä ohjeista muuhun soluun. MIT-insinöörit ovat nyt kehittäneet keinon visualisoida nämä molekyylit suuremmalla tarkkuudella kuin aikaisemmin mahdolliset koskemattomissa kudoksissa, jolloin tutkijat pystyvät kartoittamaan RNA: n sijainnin solujen läpi.

Avain uuteen tekniikkaan on laajentaa kudosta ennen kuvantamista. Ottamalla näyte fyysisesti suuremmaksi, se voidaan kuvata erittäin korkealla resoluutiolla käyttäen normaaleja mikroskooppeja, joita tavallisesti löytyy tutkimuslaboratorioista.

"Nyt voimme kuvata RNA: ta suurella spatiaalisella tarkkuudella, laajennusprosessin ansiosta, ja voimme myös tehdä sen helpommin suurissa koskemattomissa kudoksissa", sanoo MIT: n biologisen insinöörin ja aivot- ja kognitiotieteiden apulaisprofessori Ed Boyden. MIT: n Media Labin ja McGovernin aivotutkimuksen instituutin jäsen sekä Nature Methodsin heinäkuun 4. päivänä 2016 julkaisemassa tekniikasta kertovan artikkelin vanhempi kirjailija.

RNA: n jakautumisen tutkiminen solujen sisällä voisi auttaa tutkijoita oppimaan enemmän siitä, miten solut ohjaavat geenien ilmentymistä ja voivat myös heitä tutkimaan sairauksia, joiden katsotaan johtuvan RNA: n epäonnistumisesta siirtymään oikeaan paikkaan.

Boyden ja kollegat kuvasivat viime vuonna taustalla olevan tekniikan eli laajennusmikroskopian (ExM) viime vuonna, kun he käyttivät sitä kuvaproteiineihin suurissa aivokudosnäytteissä. Nature Biotechnology -lehdessä 4. heinäkuuta julkaistussa artikkelissa MIT-tiimi on esittänyt uuden version teknologiasta, jossa käytetään kemikaaleja, jotka helpottavat tutkijoiden käyttöä.

MIT: n jatko-opiskelijat Fei Chen ja Asmamaw Wassie ovat Nature Methods -paperin johtavat kirjoittajat, ja Chen ja jatko-opiskelija Paul Tillberg ovat Nature Biotechnology -paperin johtajia.

Yksinkertaisempi prosessi

Alkuperäinen laajennusmikroskoopitekniikka perustuu kudosnäytteiden upotukseen polymeerissä, joka virtaa veden lisäämisen aikana. Tämän kudoksen laajentumisen ansiosta tutkijat voivat saada kuvia, joiden resoluutio on noin 70 nanometriä, mikä oli aiemmin mahdollista vain hyvin erikoistuneilla ja kalliilla mikroskoopilla. Tämä menetelmä aiheutti kuitenkin joitain haasteita, koska se edellyttää monimutkaista kemiallista merkintää, joka koostuu vasta-aineesta, joka kohdistaa spesifisen proteiinin, joka liittyy sekä fluoresoivaan väriaineeseen että kemialliseen ankkuriin, joka koko kompleksi liittää hyvin absorboivaan polyakrylaattiin. Kun kohteet on merkitty, tutkijat hajottavat proteiinit, jotka pitävät kudosnäytteen yhdessä ja antavat sen laajentua tasaisesti, kun polyakrylaattigeeli turpoaa.

Uusissa tutkimuksissaan, jotta ei tarvittu räätälöityjä tarroja, tutkijat käyttivät eri molekyylin ankkuroimalla kohteet geeliin ennen ruoansulatusta. Tämä molekyyli, jonka tutkijat dubattivat AcX: n, on kaupallisesti saatavilla ja siksi tekee prosessista paljon yksinkertaisemman.

AcX: tä voidaan muuttaa ankkuroimalla joko proteiineja tai RNA geeliin. Nature Biotechnology -tutkimuksessa tutkijat käyttivät sitä proteiinien ankkurointiin ja he osoittivat myös, että tekniikka toimii kudoksella, joka on aikaisemmin merkitty joko fluoresoivilla vasta-aineilla tai proteiineilla, kuten vihreällä fluoresoivalla proteiinilla (GFP).

"Näin voit käyttää täysin hyllyjä, mikä tarkoittaa, että se voi integroida hyvin helposti olemassa oleviin työnkulkuihin", Tillberg sanoo. "Uskomme, että se vähentää merkittävästi esteitä ihmisille käyttämään tekniikkaa verrattuna alkuperäiseen ExM: ään."

Tätä lähestymistapaa käytettäessä kestää 500 neliömetriä 500 mikrometriä 500 neliömetrin kynnys noin tunti, käyttäen kevytlevyn fluoresenssimikroskooppia. Tutkijat osoittivat, että tämä tekniikka toimii monenlaisten kudosten, kuten aivojen, haiman, keuhkojen ja pernan osalta.

Imaging RNA

Nature Methods -papereissa tutkijat käyttivät samanlaista ankkurointimolekyyliä, mutta muutti sen sijaan kohde-RNA: ta. Kaikki näytteen RNA: t kiinnittyvät geeliin, joten ne pysyvät alkuperäisissä paikoissaan koko digestion ja laajenemisprosessin ajan.

Kudoksen laajentamisen jälkeen tutkijat merkitsevät spesifisiä RNA-molekyylejä käyttäen fluoresenssin in situ -hybridisaatiota (FISH), jota alun perin kehitettiin 1980-luvun alussa ja jota käytetään laajalti. Tämä mahdollistaa tutkijoiden visualisoivan spesifisten RNA-molekyylien sijainnin suurella resoluutiolla, kolmessa ulottuvuudessa, suurissa kudosnäytteissä.

Tämä parannettu spatiaalinen tarkkuus voi antaa tutkijoille mahdollisuuden tutkia monia kysymyksiä siitä, miten RNA edistää solun toimintaa. Esimerkiksi neurotieteessä pitkäaikainen kysymys on, kuinka neuronit nopeasti vaihtavat yhteyksiensä vahvuutta uusien muistojen tai taitojen tallentamiseksi. Yksi hypoteesi on, että plastisuutta varten tarvittavat proteiinit koodaavat RNA-molekyylit tallennetaan soluosastoihin, jotka ovat lähellä synapseja, valmiina käännettäväksi tarvittaessa proteiineiksi.

Uuden järjestelmän avulla olisi voitava määrittää tarkasti, mitkä RNA-molekyylit sijaitsevat lähellä synapseja, odottavat käännettävän.

"Ihmiset ovat löytäneet satoja näistä paikallisesti käännetyistä RNA: sta, mutta on vaikea tietää, missä he ovat ja mitä he tekevät", Chen sanoo. "Tämä tekniikka olisi hyödyllistä tutkia tätä."

Boydenin laboratorio on myös kiinnostunut käyttämään tätä tekniikkaa jäljittämään neuronien välisiä yhteyksiä ja luokittelemaan eri alityyppejä neuronien perusteella, mihin geeneihin he ilmaisevat.

menu
menu