Acid-tolerantti vihreä fluoresoiva proteiini bioimagingille

Anonim

Osakan yliopiston tutkijat kehittävät uutta vihreää fluoresoivaa proteiinia, joka kestää alhaisen pH-ympäristön happamien organelaalien kuvaamiseen

Solukomponenttien ja prosessien visualisointi molekyylitasolla on tärkeä ymmärtää minkä tahansa biologisen aktiivisuuden perusta. Fluoresoivat proteiinit (FP) ovat yksi käyttökelpoisimmista välineistä solunsisäisen molekyylidynamiikan tutkimiseksi.

FP-yhdisteillä on kuitenkin käyttörajoituksia kuvantamisessa matalassa pH-ympäristössä, kuten happamissa organeleissa, mukaan lukien endosomit, lysosomit ja kasvin tyhjiöt. Ympäristöissä, joiden pH on alle 6, suurin osa fluoripenkereistä menettää kirkkautensa ja stabiilisuutensa neutraalin pKa: nsa vuoksi. pKa on happolujuuden mitta; Mitä pienempi pKa on, sitä happamampi aine on.

"Vaikka useat happoa sietävät vihreät FP: t raportoidaan, useimmilla on vakavia haittoja. Lisäksi on olemassa puutteellisia GFP-yhdisteitä, jotka ovat käytännössä sovellettavissa bioimagingihin", sanoo Osama-yliopiston johtava kirjailija Hajime Shinoda. jonka tarkoituksena oli suunnitella happoa sietävä monomeerinen GFP, joka on käytännössä sovellettavissa elävien solujen kuvaamiseen happamissa organeleissa. "Nykyisessä tutkimuksessa kehitimme haponkestävän GFP: n, jota kutsuttiin Gamillusksi."

Gamillus on Ollindias formosan (kukkahahmakalasta) kloonattu GFP ja sillä on erinomainen haponkestävyys (pKa =3, 4) ja lähes kaksinkertainen kirkkaus verrattuna raportoituihin GFP-yhdisteisiin. Fluoresenssispektri on vakio välillä pH 4, 5 ja 9, 0, joka laskee solunsisäisen alueen välillä useimmissa solutyypeissä. Röntgenkristallografialla (tekniikka, jota käytetään kiteen atomi- ja molekyylirakenteen määrittämiseen, tässä tapauksessa Gamillus-kitee- seen) ja pistemutageneesiin viittaavat siihen, että Gamilluksen haponsietoisuus johtuu deprotonoitumisen stabiloinnista sen kemiallisessa rakenteessa. Tulokset julkaistiin Cell Chemical Biology.

"Gamilluksen soveltuvuus molekyylitunnisteeksi osoitti Gamillus-fuusioiden oikea paikallistumiskuvio erilaisissa solurakenteissa, mukaan lukien ne, joita on vaikea kohdistaa", toteaa vastaava kirjoittaja Takeharu Nagai. "Uskomme, että Gamillus voi olla voimakas molekyylityö tuntemattomien biologisten ilmiöiden tutkimiseen, mukaan lukien hapanta organeleja, kuten autofagia."

menu
menu